细胞培养常见问题

1.如何选择培养基？
    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM 中培养的细胞，很可能在DMEM 或M199 中同样很容易生长。总之，MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640 做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的是AIMV 培养基（SFM）。
2.为什么要热灭活血清？
    加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES 细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
    L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有zui终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
    GlutaMAX-I 二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定，即使在121 磅灭菌20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎*降解。
5.为什么培养基中可以省去加酚红？
    酚红在培养基中被用来作为PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
6.如何用台盼兰计数活细胞？
    用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000 个/毫升，在0.1 毫升的细胞中加入0.1 毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
7.如何消除组织培养的污染？
    当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA 过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B 推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3 代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6 代，确定污染是否以已被消除。
8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
9.Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2 培养箱。原因是什么？Hank’s平衡盐溶液（HBS）和Earle’s 平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？
    HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2 平衡，以维持溶液的PH 值。Eagles 液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks 液在CO2 培养箱中会变酸。如果希望在CO2 培养箱中保存组织，需要用Eagles 液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks 液就可以了。
10.Qualified 和 Certified 胎牛血清有什么差别?
    Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified 胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌体检验
生物化学检测
激素的检测
血红蛋白检测
Sf9 细胞生长促进及方法学检测
11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA 的目的是什么？
    二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA 清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
12.制备 lipid-DNA 的方法会影响转染效率吗？
    是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM 中，稀释DNA 在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15 分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA 溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30 分钟可以增加3 倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15 分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm 培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA 应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent 混合。LIPOFECTAMlNE 2000 的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA 和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。
13.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？
    如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。
14.如何检测内毒素(热源)水平？
    LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的zui敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin 和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL 中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL 试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10 稀释样品。稀释样品沸水育5 分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL 反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）
15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？
    如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS 培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS 培养基中。
16. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH 值会改变吗？
    对于普通使用的缓冲液，PH 值随温度变化而变化。
下表列出温度改变10℃时，PH 值的变化情况
例如 20℃下配制PH7.4 Tris 缓冲液,40℃时PH 值为 7.4-（2x0.310）＝6.78
17. 室温下(25℃)配制的Tris-HCl 溶液，在37℃使用时PH 值是多少？
    缓冲液的PH 值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。
4°C 25°C 37°C
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5
18. 昆虫细胞培养的zui适PH 值和渗透压是多少？
    生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH 值 6.0-6.4 范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的zui适渗透压是345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH 值和渗透压在以上所列的范围之内。
19. High Five 细胞有任何其它名称吗？
    High Five 细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4 和BTI-TN-5B1-4。
20.在High Five 无血清培养基中去污剂的浓度是多少？
    High Five 无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。
21.High Five 细胞用多大的密度冻存？
   3.0x10E6 cells/ml
22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？
    可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM 高6 倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640 中高25 倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。
23.如何从T25 瓶中转移sf9 细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
    我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性zui小，生活力zui高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。
胰酶消化一个T25 瓶的sf9 细胞：
1)去除培养基。
2) 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.
3) 加入2ml 1x 胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。
4) 37 ℃孵育5 到10 分钟。在仪器下检测看到5 分钟后它们正在向上移动。
5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml 培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS 终止了胰酶的活性。）
6) 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
24.在Sf9, Sf21, 和high Five 细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
    为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10 单位/毫升细胞悬液。
25.如何评估ES 细胞合格的胎牛血清？
    使用D3 ES 细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。 相关生长效率分析：当ES 细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES 细胞克隆的能力。
细胞毒分析：
    当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES 细胞和feeder 细胞的生长能力。
相关形态学和分化分析：
    检测胎牛血清支持未分化ES 细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES 细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO 的情况下进行的，培养基中出现ESGRO 会掩盖由胎牛血清所导致的问题。
（ESGRO 或LIF 经常用来保持ES 细胞处于未分化状态。）
经过培养发现，大约8 批中有1 批可以用来培养ES 细胞。
26.在重新冻存sf9 细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
    通常情况当细胞经过30 次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30 小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。