多聚甲醛固定后，白细胞的免疫表型通常会有所变化。而且，在固定之后，对细胞表面 Marker 的荧光稳定性也会产生很大影响。为了获得不同表面 Marker 的荧光稳定性，了解固定后细胞的光散射特性和射门以及固定细胞后产生自发荧光是非常必要的。

在固定细胞 0、2、4、6、24、48、96 h  后，用 FITC 标记抗体对全血进行染色测定。通过检测可溶性荧光素当量分子 (MESF) 来定量分析荧光强度。结果显示出，固定作用 48 h 后，细胞大小（FSC）和细胞颗粒度 (SSC) 能够引起显著的下降，在单核细胞中，固定作用 96 h 后，自发荧光急剧增加，是固定前的 9 倍。

从自发荧光的来看：未染色的样本在固定之后上机检测显示，荧光强度相比固定之前有所增强，自发荧光被纠正后，固定前样本间没有明显的区。在细胞固定后，淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的自发荧光持续增加，96 h 达到zui高点。判断荧光标记的稳定性之前要先进行自发荧光的校正。

大体上来讲，细胞固定后 48 h，细胞大小（FSC）发生明显降低，但到了 96 h 后则基本保持不变。在淋巴细胞、单核细胞、粒细胞均发生同样的变化。同样的，SSC 在某种程度上也出现降低的特点。

文献中 Denny 称：在固定 1、24 h、48 h 后，通过检测荧光强度说明抗体与细胞结合能力是发生了一些变化。在固定 24 h 后，CD3、CD19 有明显增加，而 CD4、CD8、CD16 则没有明显改变。在固定 48 h 后，CD3、CD4、CD19 急剧增加，使用固定后洗涤的方式，不同的表面抗原也有不同的改变，CD4、CD8、CD19 是稳定的，没有发生显著变化，而 CD3 的荧光强度却发生降低。

两种可能引起荧光强度衰退的原因：

1.NaN3；经试验验证，样本固定在 1%PFA 的 PBS（不含 NaN3）中，标记抗体的荧光强度并未发生显著的变化。

2. 固定的时间；经试验验证，在固定 30 min 后，用 PBS（含 NaN3）重悬细胞后，自发荧光增加较为平缓。而在进行自发荧光校准之后，标记抗体的荧光强度没有影响。 随着固定时间的延长，粒细胞的大小（FSC）和颗粒度 (SSC) 都有明显的降低。而淋巴细胞和单核细胞都被粒细胞覆盖上，对射门来讲都是非常困难的。

参考文献： Changes in Fluorescence Intensity of Selected Leukocyte Surface Markers Following Fixation； Judith C.Stewart；Michelle L.Villasmil ；Mark W.Frampton 等。