白细胞分类计数参考方法 
Reference leukocyte differential count method 

前    言 
 
为了保证白细胞分类计数结果具有溯源性和准确性，特制定本标准。

本标准修改采用了美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁发的《白细胞分类计数参考方法和仪器评价方法》标准（H20-A）。 

本标准从20XX年XX月XX日起实施。 

本标准的附录A、附录B和附录C都是规范性附录。 

本标准由卫生部医政司提出。 

本标准由上海市临床检验中心负责起草。 

本标准主要起草人：胡晓波、许蕾、宋颖、方心驰、张锦锋。 本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。

1 范围 
本标准规定了建立白细胞分类计数参考方法中有关样本采集、血涂片制备的要求、血涂片染色、血涂片有核细胞检查的步骤、对检验人员的要求和考核等内容。 
本标准适用于建立的实验室

2 总则 

2.1 本标准采用手工目视显微镜计数法作为白细胞分类计数的参考方法。 

2.2 为了保证参考方法检测结果的精密度和准确性，建立参考方法的实验室必须进行比对。 

3 方法 

3.1 样本采集 
将静脉血采集于EDTA－K2抗凝剂（液体或粉末状）中（浓度为每毫升血液含1.5～2.2mg EDTA－K2·H2O）。采血后立即混匀，应拒绝分析有肉眼可见凝块的样本。 

3.2 血涂片制备和要求

3.2.1 血涂片制备 

3.2.1.1 每份样本制作3张血涂片。要求所用玻片清洁、干燥、无尘，大小为25 mm×75mm，厚度为0.8～1.2mm。并有明确标记。如果样本中白细胞数量少时，需要制备更多血涂片（如6张）。 

3.2.1.2 使用EDTA－K2抗凝血液样本时，应在采集后4小时内制备血涂片。在制片前，样本应充分混匀。注意，样本不能冷藏。 

3.2.1.3 用楔形技术制备血涂片。在玻片近一端1/3处，加一滴（约0.05ml）充分混匀的血液，握住另一张较狭窄的、边缘光滑的推片，以30º～45º角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至玻片的另一端（见图1）。 

3.2.1.4  在1小时内，用Romanowsky类型染液染色；或在1小时内，用无水甲醇（含水量﹤3%）固定后染色。 

3.2.2 良好血涂片的要求 

3.2.2.1 血膜至少长25mm，至玻片两侧边缘的距离至少为5mm。 

3.2.2.2 血膜边缘要比玻片边缘窄，且边缘光滑，适用于油镜检查。 

3.2.2.3 血细胞从厚区到薄区逐步均匀分布，末端呈方形或羽毛状。 

3.2.2.4 血膜末端无粒状、划线或裂隙。所有这些情况会使白细胞集中在这些区域内。 

3.2.2.5 在镜检区域内，白细胞形态应无人为异常改变。通常，随着保存时间的延长，抗凝血会造成白细胞形态的改变，如胞浆内形成空泡，核分解破裂等。应将抗凝血液保存时间的影响减小到zui低限度。除部分淋巴细胞增生性疾病外，镜检区域内破损白细胞量应<2％。 

3.2.2.6 无人为污染。 

3.3 血涂片染色 

采用Romanowsky类染料染色。Romanowsky类染料由亚甲蓝和/或亚甲蓝氧化产物（天青B），和卤化荧光素（通常为伊红B或Y）组成。良好的染色能准确鉴别成熟和未成熟白细胞或异常细胞。 

3.3.1 染料的性能 

Romanowsky类染料的质量直接影响染色效果。在pH6.4～7.0条件下，染料与细胞中特定成分（细胞核和细胞浆特殊颗粒）相互作用，产生典型的颜色，如细胞核染深紫色，红细胞染鲜亮的橙红色。

3.3.2 可接受的染色qing况 

粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和其他细胞必须能显示清晰的核浆分界，能识别核染色质成分和细胞浆的颜色差异。 

3.4 需分类的外周血有核细胞 

外周血可见多种有核细胞。常见的有：中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。外周血中正常白细胞的形态描述见附录A。 外周血中少见的其他有核细胞在专业的血液学教科书和图谱中均有描述，本标准中不再叙述。

3.5 血涂片检查步骤 

3.5.1 血涂片显微镜检查 

3.5.1.1 首先在低倍镜下（10倍～40倍）进行浏览，观察有无异常细胞和细胞分布情况。然后，在100倍油镜下，观察细胞浆内的颗粒和核分叶情况。 

3.5.1.2 检查从约50％的红细胞互相重叠区域开始，向红细胞*散开的区域推移。血涂片较薄的区域，呈羽毛状，为“血片边缘”。 

3.5.1.3 中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞分布均匀的区域为血涂片分类“可接受”区域。当白细胞总数正常时，在血涂片尾部和边缘，每油镜视野所见的白细胞数量不超过血涂片体部的2～3倍。 

3.5.1.4 除某些病理情况（如慢性淋巴细胞白血病）外，破碎细胞或不能识别细胞的数量不超过白细胞总数的2%。若破碎细胞仍能明确鉴别（如破碎的嗜酸性粒细胞）应包括在分类计数中。在结果报告中，应设其他栏，以备填写破碎细胞或不能识别细胞，并作适当描述。

3.5.2 计数方法 

3.5.2.1 采用“城垛式”方法检查血涂片（图1）。每个明确识别的细胞必须归入下列分类中：中性分叶核粒细胞；中性杆状核粒细胞；淋巴细胞；异型淋巴细胞；单核细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；其他有核细胞（除有核红细胞外）。能明确识别的破碎细胞，应恰当分类。

3.5.2.2 每张血涂片应计数200个白细胞，若样本中白细胞数量减少，应增加检查血涂片的数量。 

3.5.2.3 白细胞分类结果以百分率和值表示。 

3.5.2.4 计数所有的有核红细胞，结果以每100个白细胞计数中见到几个表示。

3.6 检验人员要求和考核 

3.6.1 检验人员的要求 

3.6.1.1 检验人员的经验 

检验人员必须能对所有常见白细胞进行分类，并了解大多数白细胞的形态异常，包括先天性和获得性。参与细胞形态学检查的检验人员必须进行专业培训，并具备实际工作经验。 

3.6.1.2 检验人员的态度 

检验人员的工作态度、动机和专心程度是关键因素。因为白细胞分类计数是一项主观性很强的工作，影响分类计数的因素很多，有检验人员的态度、实验室环境条件和工作量等。对于以每张血涂片计数200个白细胞的参考方法工作量来说，每天每个检验人员血涂片检验数量约为15～25张。

3.6.2 血涂片考核 

3.6.2.1 考核样本 

选择10份样本。样本必须包含7种类型白细胞（中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）。其中，至少有一份样本含有少量有核红细胞，一份含有少量未成熟白细胞。 

按照3.2要求，每份样本制备5张血涂片，按照第3.3节所述方法染色，统一标签，但检验人员不知道样本来源。玻片分成5套，每套包含10份样本的玻片各1张。 

3.6.2.2 检验人员考核 

分发给参加检验的人员一套考核血涂片，要求每张血涂片做200个白细胞的分类计数，并根据血涂片编号，报告结果，交给监考人。监考人计算每份样本每种细胞的均值，进行结果解释，制作每种类型细胞分布图。其中横坐标（X轴）为组均值（百分率），组均值为实验室具备资格的检验人员计数的均值。纵坐标（Y轴）代表检验人员个体的结果。在图上添加两条代表理论上95％和99％可信区间的线条，由计数百分率的标准误算得，计算公式见附录B。

3.6.2.3 解释 
根据Gaussian分布假说，5％的个体结果可能会超出95％范围，但不会超出99％的限值。 
若数据不符合该规则，表示存在样本处理过程或操作错误（如样本标签错误，制片不佳，读片区域不当或细胞分类错误）。在分析出可能误差来源后，必须重新进行考核。若不能符合统计学规则，应高度怀疑结果的有效性。 

监考人必须仔细地检查每张图形。检验人员数值应该呈随机分布。若非如此，评价中可能引入了检验人员的偏倚。应该采取纠正措施（如培训或更换人员等），并重新进行考核。 
应保留一套考核血涂片作为标准片，用于其他检验人员的培训和考核。