一、分离纯化的基本原理  

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。   

二、试剂和材料  

无水乙醇、氯fang、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）   

三、准备工作  

RNase酶非常稳定，是导致RNA降解zui主要的物质。它在一些的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase*失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。  RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。  

1、 料制品的处理   尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：   
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。  
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。  

3）在通风柜中室温处理过夜。  
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。  

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。  

2、 璃玻和金属物品   250°C烘烤3小时以上。  

四、从组织中提取总RNA  

1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。   
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。   

五、从细胞中提取总RNA  
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol
体积按10cm2
/ml比例加入。  
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×10 6动物、植物或酵母细胞，或10 7细菌细胞。   

六、操作步骤  
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。  
2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。  
3、按200ul氯fang/ml Trizol加入氯fang，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。  

4、4℃ 12,000g离心15min。  
5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。  
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。  
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。  
9、 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。  
10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。

注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。  

12、测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/10 6 Cell）：5-15ug。 
注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染； 
高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；  
热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；  
组织块用液氮研磨，效果，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。   

6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法 
①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中； 
②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min； 
③取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯fang，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min； 
④取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm离心15min； 
⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次； 
⑥弃上清后，室温干燥5-7mins； 
⑦加入适量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（-80℃）保存，检测RNA浓度，并电泳检测。

6.1.2.2 RNA浓度测定和电泳检测 
取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。 
电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。  

6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成 
    反应按照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time) 反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。

①基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。    
        试剂                            用量

5×gDNA Eraser Buffer                   2.0 μl

gDNA Eraser                             1.0 μl

Total RNA                               X* ul

RNase Free dH2O                         up to 10 μl 
   X*：根据检测到的RNA浓度来配置； 混合均匀后，室温放置20-30min 

②反转录反应，在PCR管中配置如下缓冲液（20ul system），反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制Master Mix ，然后再分装到每个反应管中。  
           试剂                                     使用量

5×PrimeScript® Buffer 2（for Real Time）           4.0 ul 
PrimeScript® RT Enzyme Mix I                        1.0 μl

RT Primer Mix                                       1.0 μl

①的反应液                                           10.0 ul

RNase Free dH2O                                     up to 20 μl  

③混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为： 

37℃    15 min 85℃     5 sec 
然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。