一、GST融合蛋白 

GST（谷胱甘肽转移酶）能特异的与谷胱甘肽结合，表现为酶和底物的作用原理，利用这个原理，将GST做成标签表达出融合蛋白，与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合，从而纯化出目标蛋白，GST融合蛋白纯化的特点有：纯度高、纯化条件温和保持蛋白活性、促进蛋白可溶性表达等。  

二、GST蛋白结合效率太低 

1.可能原因：上样流速太快，结合时间太短 

解决方案：GST亲和层析是利用GST (glutathione-S-transferase )融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和结合，GST与谷胱甘肽的结合相对缓慢，比金属螯合亲和层析纯化his蛋白结合要缓慢很多。上样流速太快，会影响结合效率。GST亲和层析时流速适当减慢，保证足够的结合时间。  

2.可能原因：缓冲液不合适，柱子平衡不到位 

解决方案：GST亲和层析时缓冲液的pH应控制在6.5到8.0的之间，并保证足够的平衡体积数，让填料处于可以使用的状态，一般平衡10个柱床体积。  

3.可能原因：样品中GST融合蛋白浓度太低 

解决方案：因GST层析时，GST融合蛋白丰度太低时影响结合效率。对于低丰度的样品应先浓缩，在层析纯化。或者选则汇研生物的高载量GST-4FF填料。 

4.可能原因：GST蛋白发生变性或聚集 

解决方案： 
1）胞内表达的蛋白在细胞破碎时应选则合适的破碎方式，避免蛋白碳化或者变性。

2）发生聚集可以尝试添加1-10mM的DTT，促进蛋白的溶解。 

3）GST蛋白和核酸结合或者蛋白之间结合，可以适当的添加氯化钠（100-300mM)  

三、GST蛋白洗脱困难 

1.可能原因：洗脱强度不够 

解决方案： 

1）增加洗脱体积数。 

2）一般使用中建议的10mM浓度对于大多数应用来说足够了，但是也存在例外。可以尝试使用50mM Tris-HCl，20-40mM 还原型谷胱甘肽，pH8.0作为洗脱缓冲液。

3）洗脱缓冲液pH过低时，应调整pH到8-9. 

4）洗脱缓冲液的离子强度不宜太低，应控制在100-300mM氯化钠浓度。  

2.可能原因：非特异性吸附 

解决方案：洗脱缓冲液中加入1%的TritonX-100或2%的可以显著提高某些GST标签蛋白的洗脱，降低非特异性吸附和蛋白之间的吸附。  

3.可能原因：洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化了 

解决方案：洗脱缓冲液需现配现用，GTH务必使用时在加入缓冲液中，也可尝试加入1-5mM的DTT。 

四、GST蛋白纯化后纯度太低

1.可能原因：GST融合蛋白降解 

解决方案： 

1）层析体系中加入蛋白酶抑制剂,防止标签蛋白降解。 

2）GST标签部分脱落，检查序列，在宿主细胞表达的过程，宿主细胞代谢的酶使GST-tag和目的蛋白分开，此时可尝试换宿主细胞或者优化序列。  

2.可能原因：辅助表达的蛋白被表达 

解决原因：一些蛋白的表达常常需要其它蛋白辅助表达，如分子伴侣等。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表。如：DnaK，有报道这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4，pH7.4中37°C温浴10分钟而破坏。或者通过ATP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层析来除去。

五、GST蛋白的表达 

1)采用RT-PCR 扩增得到目的基因，构建到表达载体（PGEX-4T-1）上； 2)用构建质粒转化表达菌BL21，LB 平板37℃； 

3)LB 平板上挑取单一菌落接入5mL LB 培养基（100ug/mL Amp）中，37℃培养3~5h； 4)将5mL 菌液接入1L LB（100ug/mL Amp）液体培养基中，37℃培养至OD600≈0.6，加入0.3mmol/L 的IPTG，

5)20℃诱导16h；

6)将培养好的菌液于5000r/min 离心10min，弃去上清液，收集菌体，离心后菌体沉淀悬浮 于25mL Binding buffer 中。