本文汇总了流式细胞术实验中常见问题（无法标记、PE抗体检测不到但FITC可检测到、非特异性染色、荧光强度弱、散射光信号异常、结果与预期相反等），并给出了各种可能的原因以及对应的解决方法，希望对您实验有所帮助。  

一、细胞无法标记 

1．确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。

2．确保商品化抗体没有超过有效期。

3．确保已正确加入足量的抗体。 

4．确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素，需加入连接有荧光素的二抗。

5．确保二抗是好的，也就是说二抗曾经能与另外的一抗成功结合。

6．确保使用了正确的二抗，就是说二抗能够识别你的一抗。 

如果使用的是PE或APC荧光素的抗体，确保该抗体未被冰冻过。 
你要检测的组织上是否表达该抗原？可查看相关文献了解该抗原的表达情况，或者同时做一个阳性对照。 
抗体是否能识别检测物种的抗原位点？可检查抗体的交叉反应列表，看看抗体是否适用于你要检测的物种标本。不是所有的抗体都能够检测所有物种相应抗原。 7．确保使用正确的激光来激发荧光素，并使用了正确的通道来检测该荧光。  

二、PE抗体无法标记，而FITC抗体的结果却很好 

1．PE荧光素可能冰冻过。如果冰冻过，建议另外买一管新的抗体。 

2．多聚甲醛（PFA）可能会导致此问题。PFA降解后可释放出甲醇，从而影响染色。所以切记PFA尽可能新鲜配制，或者细胞尽可能不要固定，染完色就立即检测。  

三、非特异性染色 

1．非特异性染色可能是由于自发荧光。 
解决方法：用一管只加细胞不加抗体的空白管，查看细胞自发荧光水平。 
某些细胞可表达低亲和力的Fc受体CD16/CD32，这种受体可通过Fc片段结合大多数抗体。对于小鼠细胞，可使用SeroBlockFcR阻断该位点。 

2．非特异性染色也可能是由于二抗引起，建议选择一种只与一抗反应、却不会与检测组织发生交叉反应的二抗。 确保洗涤充分。 

3．小心滴定抗体。降低抗体浓度可减少非特异性染色。   

四、荧光强度弱

1．荧光弱可能是由于抗体过度稀释。因此使用前通过正确滴定抗体，以确保抗体浓度适当。

2．直标时，荧光弱也可能是由于前带现象引起（概念见表格后解释），因此，小心正确滴定抗体很有必要。 

3．荧光弱可能由于细胞数量过多。建议正确调整细胞密度，一般低于1×10E7/ml。

4．荧光弱可能是由于抗原本身就表达低，可通过查阅文献，明确抗原表达水平。

5．如果查阅到该抗原确实本身表达弱，那么建议选择更亮的荧光素。

6．在交叉反应明显的抗体中，其荧光强度弱于特异性高的单克隆抗体。

7．一抗或二抗的孵育时间和温度均需优化。 散射光异常 

8．确保细胞是新鲜收集的，否则容易出现大量死细胞和碎片。

9．对细胞进行刺激、活化时，可影响细胞散射光特性。 

10．如果要裂解红细胞，确保裂解液新鲜配制并且配制正确。  

五、结果与预期的相反 

1．有些试剂可能会影响某些抗原检测，例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。

2．裂解液也可以影响一些抗原检测，此时可采用PBMC提取法试试。 

3．有些抗原是表达在胞内的，故需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理。  

前带现象：1929年Heidelberger利用等量抗体检测浓度递增抗原，当抗原浓度较低，抗体浓度相对较高时，沉淀反应不明显；当抗原浓度增加到与抗体浓度比例合适时，沉淀反应明显；继续增加抗原浓度时，沉淀反应反而减弱。据此绘出双相应答曲线，曲线高峰区域，抗体、抗原浓度呈zui适比，沉淀反应明显，称等价带。高峰区域左侧，由于抗体浓度过高，沉淀反应不明显，称前带；高峰区域右侧。由于抗原浓度过高，沉淀反应也不明显，称后带。抗体浓度过高所致结果称前带现象，抗原浓度过高所致结果称后带现象，统称为带现象。1977年Green把此现象称为钩状效应(hook effect)，包括了前后带现象。