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碱裂解法提取质粒 DNA 操作步骤
1、挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落,接种于 20ml LB(含
Amp100ug/ml)液体培养基中,37℃、250rmp 振荡培养过夜(约
12-14hr)。
2、取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,12000rmp 离心1-2min。弃上清,将离心管倒置于卫生纸上,使液体尽可能流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡,使菌体分散混匀。),室温下放置 5-10 min。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和颠倒 eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清)。
5、加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置 5min。 12000rmp 离心 10min。溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒 DNA 复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时 K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。
6、上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯fang/异戊醇,振荡混匀, 12000rmp 离心 10min。(450μl 的苯酚/氯fang/异戊醇)
7、小心移出上清于一新微量离心管中,加入 2 倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置 2-5min,离心 12000rmp×10min。
8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次,12000rmp 离心 5 min。
9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0,含20μg /ml RnaseA,约4μl) 中,37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子,储于-20℃冰箱中。
实验试剂及配制
1、LB 液体培养基
称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5g, NaCl 10g,溶于 800ml 蒸馏水中,用 NaOH 调 pH 至 7.5,加水至总体积 1 升,高压下蒸气灭菌 15 分钟。
2、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 100mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。
3、溶液Ⅰ50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法:1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖 4.730g,加 ddH2O 至 500ml。在 121℃高压灭菌 15min ,贮存于 4℃。
4、溶液Ⅱ0.2M NaOH,1% SDS
配制方法:2M NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加 ddH2O 至 10ml。使用前临时配置。
5、溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8
配制方法:5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加 ddH2O 至 500ml。4℃保存备用。
苯酚/氯fang/异戊醇(25:24:1)
氯fang可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯fang均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。
无水乙醇
70%乙醇
TE:
10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml , 0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml,加 ddH2O 至 100ml。121℃高压湿热灭菌 20min,4℃保存备用。
1M Tris-HCl(Tris(三羟甲基)氨基甲烷):800ml H2O 中溶解 121g Tris 碱,用浓盐酸调 pH 值,混匀后加水到 1L。
0.5M EDTA(乙二胺四乙酸):700mlH2O 中溶解 186.1g Na2EDTA.2H2O,用 10M NaOH 调 pH8.0(需约 50ml),补 H2O 到 1L。
6、RNA 酶 A 母液:
将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisC· l(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。