细胞原代培养

• 胰酶消化法

1. 1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 2—3 秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏，置平皿中。
2. 2、用 Hank’s 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3. 3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2)，再用 Hank’s 液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 4、视组织块量加入 5—6 倍的 0.25%胰酶液，37℃中消化 20—40 分钟，每隔 5 分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 5、加入 3—5ml 培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6. 6、静置 5—10 分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7. 7、1000rpm，离心 10 分钟，弃上清液。
8. 8、加入 Hank’s 液 5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 9、加入培养液 l—2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。
10. 10、将细胞调整到 5×105/ml 左右，转移至 25ml 细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是zui基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同(如胶原酶，透明质酶等)。

• 组织块直接培养法

自上方法第 3 步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入 37℃ 静置 3—5 小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中(勿使组织漂起)，37℃继续培养。

• 贴壁细胞传代方法

1. 1、吸光培养瓶中的培养液。
2. 2、加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置 2-10min(显微镜下动态监测) 。
3. 3、吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
4. 4、吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。
5. 5、吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内。
6. 6、加适量新鲜培养液于新培养瓶内。
7. 7、将后者放入培养箱中培养。