一、培养基的灭菌及使用

（1）每次配置时，要注意其生产日期是否在保质期内，查看其开瓶日期及瓶口密封性，保证其未变质，并且未吸潮。

（2）培养基配置时，称量要准确，包括盐水的分装要准确。

（3）一定要保证现配制现灭菌，未灭菌的配好培养基不能长时间放置，更不可隔夜。

（4）灭菌时要保证恒温、恒压，同时要保证有效灭菌时间。

（5）灭菌过的培养基要冰箱保存，可保存一周，一般不超过 3 天。而且要遵循“先入先出”原则，先配制的要先使用。

（6）在使用时，要根据当班次的使用量，用水浴锅先将培养基溶化为液态，然后及时调低水域温度（先化好的可从水域取出，放在水浴锅锅盖上）待用，千万不可长时间使培养基处于高温状态。

（7）做产品微生物检测时，倾倒培养基温度在 45℃左右，不可过烫，避免将菌烫死；也不可过凉，化好的培养基又结块凝固，不便于观察结果。

（8）每瓶培养基均要做空白。

（9）尽量集中做样，避免频繁打开同一瓶培养基瓶塞，增大培养基的污染几率，出现误差结果。

（10）培养基剩余过少时，可先将其倾倒成空白用板。

2二、 做样环境的维持

（1）大环境（房间）

1）做样时，窗户和空调要关闭，或用酒精对房间进行喷雾消毒，避免房间内空气流通影响超净台内部环境（在有通排风系统的恒温恒湿无菌间进行操作）。

2）如果在原来的原料微生物检测室进行做样，要定期开启紫外灯，对房间进行杀菌。

（2）小环境（超净台）

1）定期清洁初效过滤器，要及时更换。

2）做样前，将超净台内部进行清洁，用 75%酒精进行擦拭消毒，并提前半小时将超净台紫外灯打开，对超净台内部环境进行杀菌。

3）关紫外灯，开风机，调整合适进风量，风量不可过低。

4）每次做样后，要对超净台内部进行清理、清洁，并用 75%酒精进行擦拭消毒。

5）紫外灯根据其使用寿命要及时更换。

6）做样同时，要做上相应菌落检测的环境空白。

7）做样区域的选择：

a、一般在距离超净台外沿的 1/3-2/3 区域进行无菌操作；

b、要在酒精灯火焰的外焰保护区域进行操作。

3三、 工器具的洁净度

（1）玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌。

（2）做样用剪刀、勺子等物品要做到做样，不可与其它操作器具混用，使用时，先用75%酒精消毒，再采用灼烧方式进行灭菌。

（3）接种针（环）采用灼烧方式进行灭菌，但要注意做样时要先将接种针（环）进行冷却。

4四、样品的采集及检测

（1）保证采样器具的无菌性

1）玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌，保证恒温、时间足够（但不可时间过长，导致玻璃器皿易裂纹而报废）。

2）取样筐：使用前要用 75%酒精进行喷洒消毒

3）取样勺、浓奶取样提子：要保证其清洁消毒，清洁后用 75%酒精进行擦拭消毒。

4）取样袋：可现用酒精进行擦拭消毒，再在超净台用紫外灯照射消毒，（包装车间要在传递窗用紫外灯照射消毒）。

5）电子称表面用 75%酒精消毒。

（2）人员操作

1）保证手部的清洗、消毒：取样前及做样前都要先洗手再消毒。

2）取样要具有代表性（随机样、目的样、综合样）且要标示清楚。

3）取样完毕，不可在车间逗留，要及时将样品放入超净台，对其外表面进行紫外灯照射消毒。

4）在要求的做样区域进行操作。

5）做样前，要用 75%酒精棉球对样品袋口部进行擦拭消毒，再开口。

6）往盐水瓶加样品时，要注意勺子或袋子尽量不接触瓶口。

7）样品计量要准确，稀释倍数也要准确（1mL 吸管不允许将管口敲掉），进行 100 倍稀释时，1mL 吸管要伸入盐水中，不可以将样品管壁流下去，同时要避免将管底部捅破。

8）盐水温度以 40℃左右为宜，不能过热，将部分微生物烫死，也不能温度太低，不能将奶粉溶解*。

9）进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性。

10）倾倒平皿时，要注意培养基瓶口不要接触到平皿；倾倒的培养基要适量，不可以太少，在培养过程中干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右为宜。

11）做大肠菌群样时，要提前将乳糖胆盐培养基培养管按需要量备好，放入超净台对外表面进行紫外线灭菌。

12）接二步时，要注意先将接种针（环）进行冷却，避免出现接不上菌落的情况发生，导致无法判断、确认。

13）做样完毕，及时放入相应培养箱进行培养，并清理清洁超净台。

5五、 微生物的培养

（1）在培养过程中，要随时监控培养箱温度，保证其在适宜的温度进行培养。

（2）要按照《微生物检验规范》要求及时观察结果，出现异常，要及时分析原因进行反馈。